豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒使用說明書
【試劑盒簡介】
豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測豬血清和組織中的PCV，適用于PCV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
提取DNA作為模板，在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴增的DNA片段進行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴增帶。
【試劑盒組份】
| 1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
| 2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
| 3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
| 4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
| 5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
| 6. 陰性對照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 陽性對照 | 300μL | |
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注：塑料袋內(nèi)試劑(陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B)-20 ℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。
【操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、扁桃體和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2樣品處理：
2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。
2.2全血樣品的處理：待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。
2.3陽性對照的處理：取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
2.4陰性對照的處理：取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1.取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入450µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min。
2.加入275µL無水乙醇，輕輕混勻。
3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱)，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
6.空柱10,000rpm離心2min。
7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中，在膜中央加入30µL洗脫液，室溫靜置2min，10,000rpm離心1min，獲得總RNA。
三、RT-PCR
1.反應(yīng)體系：分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA，混勻。
2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對照出現(xiàn)494bp擴增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)494bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【豬圓環(huán)病毒熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。
3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4.嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
5.RNA提取過程中，應(yīng)戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。
6.所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實驗室。
